單分子成像定位超分辨顯微鏡

當(dāng)前通過光活化或光開關(guān)及位置測定的超高分辨熒光成像使我們可以理解細胞功能如何在分子水平表達及編碼。在近些年所有超分辨的成像技術(shù)中，定位顯微鏡獨樹一幟，因為它傳達著單分子的分布、距離等信息。在分子水平直接產(chǎn)生實驗反饋觀察復(fù)雜的生理反應(yīng)，另外有效的染料標(biāo)識的出現(xiàn)可獲得真實的分子水平的分辨率，這使得定位顯微鏡更加強大。

定義超分辨技術(shù)

傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡在xy方向的分辨極限是250nm，z軸方向是>450－700nm。這個極限也被叫做點擴散函數(shù)PSF，是一個點的光通過顯微鏡被衍射后形成的固定尺寸，它也可以是量度的zui小尺寸的點光源或被顯微鏡可分辨的zui小物體。小于PSF的點被顯微鏡認為是與PSF相同的點。物體之間越接近于PSF寬度越不能被單獨識別。通常PSF寬度是采用Rayleigh標(biāo)準(zhǔn)：R=0.61λ/NA，NA指數(shù)值孔徑。任何克服了傳統(tǒng)顯微鏡極限至少二者其一的技術(shù)都可被稱作超分辨技術(shù)。需要指出的是，當(dāng)顯微鏡需要分辨兩個或者更多點光源的時候，很難突破光學(xué)分辨率的極限來進行定位．而當(dāng)顯微鏡的物鏡視野下僅有單個熒光分子的時候，通過特定的算法擬合，此熒光分子位置的精度可以很容易超過光學(xué)分辨率的極限，達到納米級。

設(shè)備要求

定位顯微鏡搭載起來很容易，它需要一套寬場顯微鏡，同時搭載激光光源和激光耦合器，一套靈敏的CCD系統(tǒng)，還有有效的開源的軟件算法，像奧林巴斯Olympus可以提供界面友好的集成的這樣一套系統(tǒng)cell^TIRF，可作為多通道的多維的超高分辨單分子定位的檢測平臺，它擁有其*的技術(shù)優(yōu)勢和相關(guān)的配套系統(tǒng)以保證商業(yè)市場上可獲得的zui高單分子檢測級別的同步多色TIRF光學(xué)質(zhì)量。其TIRF物鏡是相關(guān)領(lǐng)域研究大牛的，實驗條件通過實驗管理界面很容易的控制。總的來說奧林巴斯的TIRF主打市場。

算法

定位顯微鏡確實需要圖像處理的技術(shù)，基于高分辨重建圖像，我們可以用下面開源的軟件算法來進行模擬定位的計算：

• Samuel Hess
• Xiaowei Zhuang
• Ricardo Henriques (QuickPALM plug in Image J)

標(biāo)本準(zhǔn)備

為了得到更好的分辨率的應(yīng)用zui主要依賴于標(biāo)本的制備，而zui小程度的是依賴于顯微鏡和算法，每個用戶的應(yīng)用需要找到適合自己標(biāo)本的條件，比如：激光強度、照射時間、區(qū)域和重復(fù)次數(shù)、背景抑制、染料標(biāo)注表達水平等因素。同時載物臺的穩(wěn)定性及Z軸的穩(wěn)定性也是為了獲得準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)而必須考慮的因素。

顯微鏡技術(shù)和細胞生物學(xué)的發(fā)展經(jīng)常給我們帶來戲劇性的跳躍，生物學(xué)家不再受限于僅僅從總體運動的可視的分子相互作用上進行推理，而是當(dāng)他們劇烈作用時，可能看到單個的分子。超高分辨率顯微鏡可以給生物學(xué)家在一個全新的水平上研究細胞內(nèi)部的工作狀態(tài)。